测abts吸光度用什么调零_abts的吸光度

       很高兴能够参与这个测abts吸光度用什么调零问题集合的解答工作。我将根据自己的知识和经验，为每个问题提供准确而有用的回答，并尽量满足大家的需求。

1.ELISA试剂盒有几种检测方法

2.如何设计一种检测动物或植物中某的免疫学方法(只有已知的该标准抗原)

ELISA试剂盒有几种检测方法

       1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃?过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

       2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃?孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

       3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃?孵育0.5～1小时，洗涤。

       4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃?10～30分钟。

       5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

       6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

       间接法

       1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；

       2.次日洗涤3次；

       3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；

       4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；

       5.37℃孵育35-60分钟，洗涤；

       6.’最后一遍用DDW洗涤。

       其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

如何设计一种检测动物或植物中某的免疫学方法(只有已知的该标准抗原)

       　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

       （一）双抗体夹心法

       双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

       （二）双位点一步法

       在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现阴性结果。

       （三）间接法测抗体

       间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

       （四）竞争法

       竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

       （五）捕获法测IgM抗体

       血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

       （六）应用亲和素和生物素的ELISA

       亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素（streptidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。　ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酶或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。

       这个得具体问题具体分析。看你想达到什么检测目的了，另外还得看是什么，存在于动植物什么部位。最简单的就是沉积实验：用标准抗原免疫鼠或兔等使其产生抗体，再用其血清作个沉积实验就可以了。这个实验不敏感，需要抗原抗体量较大，如果是特殊或是感染初期，则检测不到。如果你有条件的话可以做ELISA，这个实验敏感性强。

       一,基本原理

       它用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原.

       在这种测定方法中有3种必要的试剂:

       ①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)

       ②酶标记的抗原或抗体(标记物)

       ③酶作用的底物(显色剂)

       测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,

       再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色.

       其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比.

       这种有色产物可用肉眼,光学显微镜,电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定.

       其方法简单,方便讯速,特异性强.

       二,酶及其底物

       酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物.是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物 ,将得到不同的颜色反应.

       360,450

       420

       荧光

       **

       甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

       硝基酚半乳糖苷(ONPG)

       β-D-半乳糖苷酶

       405

       420

       **

       深蓝色

       ABTS+HRP+葡萄糖

       葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰

       葡萄糖氧化酶

       400

       500

       **

       红色

       4-硝基酚磷酸盐(PNP)

       萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐

       碱性磷酸酯酶

       492

       460

       449

       425

       642

       橘红色

       **

       棕色

       兰色

       蓝绿色

       邻苯二胺

       四甲替联苯胺

       氨基水杨酸

       邻联苯甲胺

       2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

       辣根过氧化物酶

       测定波长

       显色反应

       底 物

       酶

       ELISA的种类和变化

       (一)双抗体夹心法

       (二)间接法

       (三)竞争法

       (四)双位点一步法

       (五)捕获法测IgM抗体

       (六)应用亲和素和生物素的ELISA

       (一)双抗体夹心法

       此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原

       获得待分析物的未标定抗体

       将特异性抗体与固相

       载体连接形成固相抗体

       洗涤除去未结合的

       抗体及杂质

       加入封闭蛋白溶液以封闭载体

       表面残留的蛋白结合位点

       洗涤并除去未结合的封闭蛋白

       加受检标本(抗原)形成

       固相抗体-抗原复合物

       洗涤除去其他

       未结合的物质

       加酶标抗体生成

       抗体—待测抗原—酶标记抗体

       的复合物

       彻底洗涤

       未结合的

       酶标抗体

       加底物进行

       酶催化反应

       根据颜色反应的

       程度进行该抗原

       的定性或定量测定

       间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法.

       (二)间接法

       包被固相载体:

       用已知抗原包被

       固相载体

       加待检标本:

       使相应抗体与固相抗原结合

       洗涤,除去无关的物质

       加酶标抗抗体:

       与固相载体上抗原抗体

       复合物结合;洗涤,除去

       未结合的酶标抗抗体

       加底物

       显色

       根据颜色反应的程度进行

       该抗原的定性或定量测定

       (三)竞争法

       此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体 .

       用已知特异性

       抗体包被

       固相载体

       测定管加待测抗原和

       一定量的酶标抗原使二者与

       固相抗体竞争结合

       对照管只加一定量酶标抗原

       与固相抗体直接结合

       分别洗涤

       除去未结合

       的成分

       加底物显色

       分别测定两管的吸光度值,

       根据对照管与测定管吸光度值之比,

       计算标本中待测抗原含量

       对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合,故分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异.如待测抗原量多,竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合的酶标抗原量减少.因此,加入底物后显色反应较弱.

       特点一:灵敏性

       该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶.众所周知, 酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ,产生可供观察的显色反应现象.因此该体系常被称为酶放大体系.ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克,甚至纳克水平上对其进行定量.

       例如,在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml .

       特点二:特异性

       其特异性来自抗体或抗原的选择性.抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间.由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性.

       例如乙肝中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应.抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物.

       ELISA应用实例

       饲料中盐酸克伦特罗的测定

       饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素 )

       饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏菌 )

       甲胺磷残留分析

       甲基对硫磷残留分析

       呋喃丹残留分析

       ELISA在饲料安全检测中的应用

       ELISA用于农药残留的检测

       河豚毒素

       植物毒素如**碱,,藻类毒素

       苯并芘

       主要有除草剂与杀虫剂两大类

       例如杀暝松( FN ),

       甲氟磷酸异已酶( SOMAN ),

       草不绿( Alachor ),

       西维因( Carbaryl ),

       多菌灵及克菌丹( Captan )等.

       农药的检测:

       ELISA检测 "非典型肺炎"冠状

       ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体

       ELISA在疾病诊断中的作用

       ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

       ELISA试剂盒商业资讯

       ELISA试剂盒

       酶联免疫井

       DNM-9602G酶标分析仪

       DNM-9602 标配酶标分析仪

       DNM-9602A酶标分析仪

       几种酶标分析仪

       (一) 原理

        ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

       (二) 操作步骤

        方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

        1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

        2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

        3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

        4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

        5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

        6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

        方法二 用于检测未知抗体的间接法：

        用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

       (三) 试剂器材

        1. 试剂

        (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

        NaCO3　1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml

        (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml

        (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。

        (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

        (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。

        (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl

        (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl

        (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。

        (9) 正常人血清和阳性对照血清。

        2. 器材:

        (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

        (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

        (3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

       (四) 注意事项

        1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

        2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

        (1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

        （2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

        (3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

        (4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

       好了，关于“测abts吸光度用什么调零”的话题就讲到这里了。希望大家能够通过我的讲解对“测abts吸光度用什么调零”有更全面、深入的了解，并且能够在今后的工作中更好地运用所学知识。